猪副粘病毒（蓝眼病病原）分离株N基因的实时定量RT-PCR应用分析

来源：湖南新南方养殖服务公司 2015-05-28 16:44:57| 查看：次

中国养猪网讯:

　　引言

　　猪蓝眼病（BED）是墨西哥的地方流行性疾病，20世纪80年代初首次报道，研究已发现有3种基因型组与疾病的各种临床表现有关。多采用血凝抑制试验（HI试验）和病毒分离诊断猪副粘病毒（PorPV）。此外，细胞系对感染的敏感性取决于病毒基因组，是可变的。可用巢式RT-PCR检测病毒基因组，但该法只在做流行病学调查时检测LPMV（拉帕丹密考克病毒）原型株时使用。该法是否能够检测其他猪副黏病毒毒株还是未知的。由于该法检测灵敏度不高，且缺乏足够的量化方法，因而很有必要研发出更快速、更灵敏的PorPV毒株检测方法。本研究的目的是建立一种可以检测3种不同型PorPV毒株基因组的诊断方法，即实时定量RT-PCR（qRT-PCR）检测方法，并且对该法的有效性和敏感性进行评估。用实时定量RT-PCR检测实验感染PorPV的猪，同时对该方法的灵敏度和特异性也进行了评估。

　　材料和方法

　　选用1980-2003年间分离到的9个PorPV分离株来验证qRT-PCR试验。先将病毒接种于GMK细胞中置于96孔板中培养。实验所用培养试剂都是经过细胞病变检测、血凝和间接免疫荧光试验评估筛选出来的。用Reed和Muench法来计算滴度，表示为50％组织培养感染剂量（TCID50）。为了便于统计，将滴度转化为log10值。给8只6周龄的生长猪鼻内接种4 mL PAC-3型病毒株（1×106 TCID50/mL），于接种前2天到接种后17天之间分别采集鼻腔拭子和口腔拭子各47份，然后用美国QIAamp公司的病毒RNA™提取试剂盒对感染病毒的培养物上清液和拭子样品进行RNA抽提，备用，操作按试剂盒要求规范进行。提取到的RNA用于后续PorPVN基因的定量分析，以上即为进行实时定量RT-PCR的步骤。

　　结果

　　该技术能检测到病毒的极限含量是102滴度。当PorPV的RNA浓度达到TCID50的百分之一时就能被检测出来。表1列出了9个PorPV毒株用定量病毒RNA检测法和病毒滴定法两种方法之间的显著差异。在本次实验中，与病毒分离方法相比，qRT-PCR检测阳性样品的敏感性更高（87.1-83.9％）。