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猪细环病毒的诊断方法

来源:未知 2012-09-07 17:17:50| 查看:

中国养猪网讯:

  对于猪TTV的检测,基于目前对猪TTV的了解还非常有限,在已有的基因组序列基础上,利用PCR方法检测猪TTV成为研究猪TTV的重要手段。PCR 作为诊断方法,具有敏感度高、特异性强、诊断时间快等优点。

  目前用于猪 TTV 检测的方法有常规PCR、巢式PCR、多重引导滚环式扩增法。常规PCR和巢式PCR方法均根据目前发表的猪TTV基因序列的保守非编码区设计引物,对相关的病料组织进行检测。多重引导滚环式扩增法是以随机寡核苷酸作为引物,利用噬菌体hpi29 DNA聚合酶的DNA链取代作用的特性,在恒温下以滚环扩增待测环状DNA。扩增产物经限制性内切酶消化即可得到大量的单位长度DNA。该方法不需要知道待测病毒的基因组序列。

  从1997年发现TTV以来,学术界对其做了深入的研究和探讨,论证了该病毒为一种小的十二面体无囊膜单股环状负链DNA病毒,能感染多种脊椎动物,包括人和猪。2002年,日本学者Okamoto等首次从猪体内检测到种属特异的猪TTV的存在,与人TTV属于同一类,TTV无处不在,呈全球性分布。

  尽管猪TTV无处不在,但其致病性仍不清楚,并不引起具体的疾病,只是证明了TTV与PRRSV(蓝耳病病毒)、PCV2(圆环病毒2型)等混合感染会加重猪皮炎肾病综合征(PDNS)和断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的症状。感染灵长类和其他哺乳动物的TTV的基因组成结构和转录谱与人TTV是相似的,并随宿主共同进化。由于TTV感染灵长类和其他哺乳动物,推测很可能所有的动物都自然感染了种属特异的TTV,但这并没有被充分证明。

  猪细环病毒的分子生物学检测方法由于目前没有建立起培养猪细环病毒的组织培养方法,因此还不能用病毒的分离鉴定TTV感染。目前已从猪源疫苗、酶制剂和药物中检测出猪细环病毒基因组。

  另外实验室用于病毒分离鉴定和疫苗生产用的各种细胞几乎都存在猪TTV的污染。因此PCR技术被优先考虑用来检测TTV,它能检测出未出现抗体反应的血清标本中极微量的病毒核酸序列。

  到目前为止,PCR检测方法是检测TTV非常有效的方法,也有人研究使用斑点杂交的方法。与斑点杂交方法相比,PCR方法的灵敏性更高;但是斑点杂交法的特异性要优于PCR。若能结合两种方法的优点会是一个很好的检测方法,很多学者在这一方面做了大量的研究,也取得了一定的成果。利用PCR方法检测TTV DNA应注意两个问题:

  ①引物的选择。通过不同地区 TTV 全基因组序列比对发现,不同毒株位于1 847~2 346 bp区域的片段变异较小、相对保守,是设计引物的较佳选择区域。为提高检出率,减少错检、漏检,最好设计不同区段多对引物对TTV进行扩增。

  ② DNA提取方法。研究结果表明,利用常规提取TTV DNA的方法漏检率很高,原因可能为TTV是基因组较小的单链DNA病毒(属圆环病毒科) 和TTV在感染血清中滴度差别较大(2~3个数量级)。

  2010年,Andreas Gallei等运用基因特异性多重PCR同时检测TTV1和TTV2,TTV1感染率为32%,TTV2感染率为17%,TTV1与TTV2共感染率为32%。2008年,Brassard等为了解猪和牛TTV感染情况,研究了实时PCR检测方法,此方法优化和发展了TTV分子生物学检测方法,并得出TTV在猪群与牛群中广泛流行;2009年,Tanja Pozzuto等用非编码区设计特异性引物,采用巢式PCR和非巢式PCR两种方法对母猪和仔猪TTV感染情况进行检测,表明TTV可以垂直传播,胎儿感染率很高。

  2005年,Joaquim Segales等用常规PCR方法对1985—2005年西班牙猪群TTV1和TTV2感染情况进行调查,为TTV对动物的感染留下了最早的证据。2007年,Kekarainen等采用巢式PCR方法对猪血清和精液进行TTV检测,结果表明血清中TTV感染率为74%、精液中为72%,精液中TTV的高检出率显示TTV可能通过性途径传播;2006年,LauraMartinez等用巢式PCR方法对欧洲野猪感染TTV检测,结果表明TTV1在欧洲野猪群中的流行率为58%、TTV2流行率为66%。2008年Mohammad Ir-shad等根据TTV ORF2中的保守区域设计特异性引物,运用RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)检测方法,对印度TTV流行情况进行调查。

  2005年,Niel等利用滚环扩增方法检测猪血清中的TTV,扩增产物经BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、PstⅠ和 PvuⅡ消化后得到长为2 872 nt 和 2 735 nt2个基因组,继而发现猪TTV的另一种基因型。

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