中国年产蚕沙40万t，常作废弃物处理，综合利用少，污染环境，严重浪费资源。从蚕沙中提取的叶绿素及其衍生物(chlorophyll derivatives，CPD)等，可用于生产医药、食品及化妆品，创造良好的经济效益。叶绿素衍生物具有促进造血功能、抗肿瘤、杀菌、抗诱变、保肝及抗溃疡等多方面的生物活性，其理化性质相对稳定，且无毒副作用，在各方面有着极为广泛的应用。镁叶绿酸钠(Sodium Magnesium-chlorophyllin) 是从蚕沙中提取的叶绿素衍生物。Mekler等将镁叶绿酸钠加于亚洲甲型流感病毒101株或牛痘病毒悬液中，3 min后部分病毒粒子膜即遭破坏，30 min后核酸也遭到破坏;将镁叶绿酸钠局部应用于皮肤科和眼科疱疹病人，显示有明显的抗病毒作用。但是，对于其能否有效抑制猪流感病毒，国内尚未见报道。
 

　　通过低血清培养非洲绿猴肾细胞(Vero)，在添加胰酶的条件下进行体外病毒感染。将病毒与药物通过3种不同给药方式作用于细胞，导致细胞病变(CPE)，通过观察细胞病变效应观察镁叶绿酸钠对猪流感病毒的抑制及对被感染细胞的保护作用，为临床抗病毒感染药物的研发提供试验依据。
 

　　猪流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)属正黏病毒科流感病毒属，可引起猪流感(Swine Influenza，SI)，且引起猪流感发生的主要是A型流感病毒。SIV可引起不同日龄、性别和品种猪发生急性、热性和高度接触性、群发性呼吸道疾病，临床上以突发、高热咳嗽、呼吸困难，怀孕母猪繁殖障碍、流产、死胎等病症为主，SI也是导致猪免疫抑的主要疾病之一。
 

　　一、 药物的抗病毒试验
 

　　1、对病毒感染的治疗作用

　　在96孔细胞培养板上培养细胞，待细胞长成单层后弃去培养液，用Hank's液洗涤3~5次。第 1~10 列加入 100 TCID50病毒及50 μL/孔病毒吸附液;第11列为阳性对照，即不加药物、加入等量病毒液和吸附液;第 12 列为空白对照，即不加病毒液，加入等体积病毒吸附液。37 ℃、5%CO2恒温培养箱中作用1 h，再加入50 μL/孔病毒维持液，37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养4 h。4 h后弃去含病毒的维持液，第1~10列分别加入10个不同浓度的药物稀释液100 μL/孔，参照2.4所得药物对细胞的安全浓度结果设定浓度范围，分别为33 μg/mL、16.5 μg/mL、8.25 μg/mL、4.125 μg/mL、2.063 μg/mL、1.031 μg/mL、0.516 μg/mL、0.258 μg/mL、0.129 μg/mL和0.064 μg/mL，第11、12列加入等量Hank's液。置于 37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养1 h后，加入100 μL/孔细胞培养液，37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，每间隔10 h观察细胞生长情况。观察病毒致CPE的孔数，有CPE出现记为“+”，无CPE出现记为“-”。
 

　　2、对病毒感染的预防作用

　　在96孔细胞培养板上培养细胞，待细胞长成单层后弃去培养液，用Hank's液洗涤3~5次。第 1~10 列分别加入 10 个不同浓度的药物稀释液100 μL/孔，药物浓度同2.5.1;第11、12列加入等量Hank's液。置于 37 ℃、5%CO2恒温培养箱中作用1 h后，再加入100 μL/孔细胞培养液;37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养4 h，4 h后弃去孔内液体，第1~11列加入100 TCID50病毒及50μL/孔的病毒吸附液，第12列为空白对照，即不加病毒，加入等体积病毒吸附液。置于 37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，每间隔10 h观察细胞生长情况。
 

　　3、对病毒的直接阻断作用

　　在96孔细胞培养板上培养细胞，待细胞长成单层后弃去培养液，用Hank's液洗涤3~5次。第 1~10 列加入 10 个不同浓度的药物稀释液(100 μL/孔)、100 TCID50病毒液/孔及病毒吸附液(50 μL/孔) 的混合液，药物浓度同2.5.1;第11列为阳性对照，即不加药物、加入等量Hank's液(100 μL/孔)、100 TCID50病毒液/孔及病毒吸附液(50 μL/孔)的混合液;第12列为空白对照，即不加病毒液、加入等量 Hank's 液和病毒吸附液。置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，每间隔10 h观察细胞生长情况。
 

　　二、 结果

　　1 、药物对病毒感染的治疗作用

　　通过观察，病毒对照组细胞在第5天全部出现CPE，而镁叶绿酸钠浓度在0.516 μg/mL时细胞均未出现异常，对病毒有抑制作用，能判定没有病毒致细胞病变，在此浓度下能阻止病毒增殖。
 

　　2、药物对病毒感染的预防作用

　　通过观察CPE综合判断，经作用24 h，药物浓度在2.063 μg/mL时仍然有细胞产生病变，对病毒的抑制作用不明显，判定该镁叶绿酸钠在病毒侵入细胞早期的抑制作用不突出。
 

　　3、药物对病毒的直接阻断作用

　　结果表明，镁叶绿酸钠与病毒混合液作用12 h后使猪流感病毒的感染力明显减弱，其最小作用浓度为0.258 μg/mL，未加药物的病毒对照组细胞全部出现CPE。
 

　　小结：

　　由于药物滥用问题长期存在，导致病毒对常见的抗病毒药物敏感性降低，严重影响抗病毒药物的治疗效果。因此，抗病毒药物的筛选工作成为关注热点。目前，已报道的大多是抗生素及中药提取物在体外细胞水平或者鸡胚水平上的抗病毒研究。但近年对蚕沙中提取的叶绿素衍生物的抗病毒作用研究甚少，目前国内尚未见报道。
 

　　叶绿素衍生物是一类很有理论研究与药用价值的化合物。在本次研究镁叶绿酸钠体外抗猪流感病毒的试验中，通过低血清培养非洲绿猴肾细胞(Vero)，在添加胰酶的条件下进行体外病毒感染对蚕沙提取物镁叶绿酸钠的抗流感病毒作用进行研究，评价其能否有效抑制猪流感病毒H3N2亚型。综合 3 种给药方式：在感染猪流感病毒(H3N2)并同时加药的方式下，镁叶绿酸钠对Vero细胞有明显的保护作用，与空白对照组无太大差异，证实了药物对猪流感病毒(H3N2)有直接杀灭作用;在先感染病毒再加入药物的情况下，镁叶绿酸钠对Vero细胞有一定的保护作用，镁叶绿酸钠浓度在0.516 μg/mL时细胞均未出现异常，能判定没有病毒致细胞病变，在此浓度下能阻止病毒增殖;在先加入药物后感染病毒的情况下，镁叶绿酸钠对Vero细胞保护作用不强，在药物安全浓度范围内抑制病毒增殖现象不明显，与病毒对照组无太大差异，均存在一定程度的细胞病变。分析原因可能是细胞与药物作用的时间不够、细胞吸收药物不全可间接降低药物有效浓度，对病毒作用减弱;故可在今后试验研究中延长药物作用时间，进一步研究其作用效果。
 

　　病毒在细胞内复制是决定感染与发病的重要因素，药物抑制机体细胞内病毒复制的过程是衡量抗病毒药物作用的重要指标。本试验中药物作用病毒的相关数据可为临床抗病毒药物研发提供试验依据。其药物作用于机体内效果及药物作用病毒是否是因为病毒粒子膜被破坏或者是核酸遭到破坏有待进一步研究。