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猪细环病毒分型的检测

来源:未知 2012-09-07 17:31:30| 查看:

中国养猪网讯:

  基于TTV编码区和非编码区序列变异极高,TTV具有多个基因型,国外学者已经提出很多分类系统。几种分型技术,包括使用引物特异的PCR方法和DNA序列分析。为了解猪 TTV 的分型情况,以获得高通量检测,德国学者通过研究建立了一种多重实时PCR(rt-PCR) 技术同时有效地检测猪TTV1和TTV2。

  通过该方法对203份猪血清样品进行检测,结果发现TTV1、TTV2单独感染和TTV1/TTV2混合感染的血清阳性率分别为32%、17%和32%。同时,基因型特异的rt-PCR标准的建立确定了感染猪血清中的平均病毒基因组载量约为104.5/mL。多重实时PCR技术具有方便、省时的优点,可为临床提供更多、更准确的诊断信息。目前,根据不同的基因型设计特异性引物,运用巢式PCR方法检测不同基因型的TTV感染,其特异性和敏感性都较好,适合临床应用,采用巢氏PCR方法扩增的DNA片段为保守的部分非编码区片段,对其克隆测序,并进行序列分析,通过构建进化树达到分型的目的。

  而伊朗学者采用了一种相对简单的方法对TTV进行分型,这是基于神经网络和限制性内切酶谱的一种分型方法。通过使用人工智能从复杂的限制性内切酶图谱中精确预测TTV基因型;而神经网络模型是基于TTV非编码区限制性酶切位点的变化而构建的。这种方法提示了限制性内切酶图谱是一种更加精确的TTV分型方法。这种将限制性内切酶图谱和人工神经网络模型相结合用于TTV分型成为TTV分型的法则。这种模型具有分析能力强大且耗时短的优点,也将被用于已知和未知病毒核酸序列的进一步矫正分析。

  猪细环病毒的血清学诊断法虽然目前检测TTV感染的主要方法是血清PCR,但由于其受外界各种因素的制约,不宜推广应用。而且,对于 TTV DNA 的检测只能反映病毒感染发展到毒血症时期的感染,而不能对猪群TTV

  感染状况进行调查,即不能反映猪TTV的流行情况,对既往感染也无能为力。尽管猪 TTV 血清学方法的研究落后于人TTV,但到目前为止,对于猪TTV已开始深入研究其主要的开放阅读框(ORF1、ORF2和ORF3)的结构和功能,对于猪TTV抗原基因已有一定的研究。2011 年,Huang 等已深入研究了猪TTV2衣壳蛋白在E.coli中的表达特性,建立了Westernblot和ELISA血清学诊断方法,结果显示来自不同规模猪场的猪血清阳性率相对无菌猪群较高;并运用该方法研究了猪TTV病毒载量与IgG抗体水平的关系,结果显示,未被检测出PTTV2病毒载量的猪很可能含有更低的抗TTV2抗体水平,同时对来自一规模猪场的10头猪长达2个月的血清学分析结果显示,病毒载量的降低或病毒的清除率与抗ORF1IgG抗体水平的升高有关。更有趣的是,学者发现,受猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)影响的猪的TTV2抗体水平显著低于未受PCVAD影响的猪。ELISA 方法的建立有助于澄清TTV感染的潜在病因。该方法的建立使猪TTV的检测方法更加方便、快捷。

  病理组织学诊断为研究猪TTV1(PTTV1)能否在无菌猪体内感染和引起疾病,加拿大学者采用PTTV1核酸阳性的猪骨髓和肝脏匀浆液,这种匀浆液通过氯仿等处理,无菌猪体内经过4个系列循环感染无菌猪形成单一PTTV1核酸DNA感染因子,注射2日龄无菌猪,感染后于不同时间点宰杀无菌猪,制作病理切片,并进行免疫组织化学和原位杂交法分析。结果表明,所有的试验猪均无任何可见临床症状,但发展为间质性肺炎、短暂的胸腺萎缩、膜性肾小球性肾病,肝脏组织中有中度的淋巴细胞和组织细胞渗出,而在注射缺乏TTV DNA的匀浆组织的无菌猪中并未见到这些显微病理变化。

  运用原位杂交方法在骨髓单核细胞中鉴定出PTTV1基因组。这证明了PTTV1能使无菌猪产生特异性病理变化,是未被认识的一种具有致病性的猪病毒性传染性病原。这也揭示,指环病毒属的这种病毒能够直接诱导TTV感染致猪发生组织损伤。

  那么PTTV2(猪TTV2)基因型是否会使猪发生组织损伤,与PTTV1相比,损伤有何不同,混合感染致猪损伤又如何,这些问题急需要进一步研究。

  尽管已经有了流行病学证据表明TTV与人类的某些疾病有一定联系,但一直以来都没有证明能够引起具体的疾病。近来对猪自然感染 TTV 和其流行病学与人TTV相似的认识,使科学家想到将猪作为研究人TTV的动物模型的可能性。将猪作为实验动物模型有助于对人TTV感染的研究。TTV 感染模式和可能疾病相关性是基于PCR方法的流行病学研究,考虑到猪在形态和生理方面与人的相似性,当前使用猪作为研究人类疾病的动物模型。因此,这也就可能建立一种新的调查工具,即适宜的实验动物模型系统来研究TTV感染的流行病学、传播途径、免疫反应和潜在的致病性。

  虽然学术界一直都在致力于TTV的研究并取得了一定进展,但仍有许多问题没有解决,仍需进一步建立TTV感染的其他动物模型,探索致病机理和病理损伤,筛选和评价TTV感染的治疗和预防药物,以及研制TTV疫苗等。

  目前已从猪源疫苗、酶制剂和药物中检测出猪细环病毒基因组。另外实验室用于病毒分离鉴定和疫苗生产用的各种细胞几乎都存在猪TTV的污染。近 10 年来,TTV 的检测技术得到了飞速发展,从DNA核酸检测到血清免疫学方法的成功建立,从常规PCR定性到多重实时定量方法的建立,检测的特异性和灵敏度均得到提高,成功构建了猪TTV感染的病毒血症的病毒载量标准,让我们对TTV在猪群中的感染状况有了更加深刻的认识。但猪 TTV 单独感染的致病性如何、会产生怎样的免疫学反应、如何寻找用于培养 TTV 的细胞系,仍是学术界急需解决的争论性问题。

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