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我国新发现猪丁型冠状病毒病

来源:猪业科学 2016-07-14 10:31:23| 查看:

  猪丁型冠状病毒又称猪德尔塔冠状病毒(PDCoV),是一种新发现的冠状病毒,它主要感染整段小肠,尤其是空肠和回肠,引起严重的肠炎并伴有小猪的腹泻和呕吐。2009—2010 年PDCoV 在中国香港首次报道该病毒。2014年初,在美国首次报道猪群该病的流行,此后至少有19个州有该新型冠状病毒的报道。在美国,猪丁型冠状病毒感染与猪流行性腹泻(PED)和猪传染性胃肠炎(TGE)的临床发病情况比较相似,但是发病症状相对较轻。新型猪肠道冠状病毒病可引起乳猪腹泻和呕吐,发病率和死亡率高达50% -100%,生长猪和成年猪感染后死亡率低。现将本次病例报告如下。

  材料与方法
 

  病料
 

  来自华南某集约化猪场(2000头基础母猪)3~7日龄的乳猪5头,全场乳猪发生严重腹泻,传播迅速,发病率90%、死淘率90%以上。采集发病猪的小肠,按1:5研磨制备成病料,-80℃冻存待检。
 

  主要试剂
 

  RNA抽提试剂盒购于上海A公司,反转录酶、RNA 酶抑制剂、dNTP、18T载体克隆试剂盒、DL2000 DNA Marker、胶回收试剂盒、DH5α感受态细胞等购自TAKARA公司。
 

  引物设计与合成
 

  本实验室根据GenBank 所发布的序列号,选择N基因,运用Primer Premier5.0分别针对PDCoV、PEDV、TGEV、和RTV(猪轮状病毒)设计4对引物,由B公司合成,预计扩增的特异性基因片段大小为482 bp、450 bp、810 bp 和620 bp。
 

  总RNA 的提取
 

  病料经离心取上清液,按照ANYGEN 核酸提取试剂盒说明书提取病毒总RNA,然后用物RNA 酶的水溶解,放在-80℃保存。
 

  RT-PCR 的检测
 

  反转录体系:ddH2O 4 μL,下游引物R 1μL,RNA1μL,70 ℃水浴10 min 冰浴2 min ;5×MLV buffer 2μL,ddH2O 1μL,dNTPs 0.5μL,RNA 酶抑制剂 0.25μL,MLV 反转录酶 0.25μL,42 ℃水浴1 h,72 ℃水浴15 min冰浴至冷却。PCR 体系:ddH2O 32.5μL,10×MLV buffer 5μL,dNTPs 4μL,F 2μL,R2μL, cDNA 4μL,rTaq 0.5μL。反应条件为94 ℃ 5 min,94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃30 s,30Cycles ,72 ℃ 7 min,PCR 反应产物于1.0% 琼脂糖凝胶电泳。
 

  克隆
 

  将阳性PCR 产物经纯化回收后与PMD-18T 载体连接,转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中,培养后挑单个菌落进行PCR 鉴定,鉴定成功的重组质粒送往B公司进行测序。
 

  序列分析
 

  将RT-PCR 扩增获得的N 基因进行克隆、测序, 利用MEGA6 软件处理,与GenBank 上已公布的PDCoV 毒株的N 基因序列(表1)进行同源性比对分析,并绘制系统进化树。
 

  结果与分析
 

  病猪症状和病变
 

  该集约化猪场5至15日龄乳猪发生传播迅速的严重腹泻,迅脱水死亡,死淘率高达90%以上。症状见剖检病变见图1和图2。主要在小肠,肠管明显扩张, 内充满黄色液体, 肠壁变薄、松弛、小肠黏膜充血, 肠系膜呈索状充血。

       
4种病毒N 基因扩增
 

  应用RT-PCR 方法对样品进行了PEDV/TGEV/RV/PDCoV 检测,结果显示PEDV/TGEV/RTV 未能扩增出目的条带,而PDCoV 扩增出与预期大小一致片段,约482 bp,电泳图见图3。检测结果显示该病料PEDV/TGEV/RTV 为阴性,PDCoV 为强阳性,说明该猪场可能存在PDCoV 的感染。
 

  PDCoV N 基因序列分析
 

  由测序结果可知,Ch-A测序的N 基因中间存在一个核苷酸的缺失、几个突变。运用DNAstard 软件将测序正确PDCoV N 基因序列与GenBank 上已发表的国内外毒株N 基因参考序列进行同源性比对分析,结果显示获得PDCoV 毒株N 基因之间的核苷酸序列同源性为98.3%到100%,氨基酸序列同源性为95.0%到100% ;其中TX 与中国已公布毒株相比核苷酸同源性为98.3%到99.0%,氨基酸同源性为95.0% 到96.9%,显示与中国香港毒株HKU15-155 同源性最低;与韩国和美国毒株相比核苷酸同源98.8%-99.0%,氨基酸同源性为96.2% 到96.9%。

   
 PDCoV N 基因遗传进化分析
 

  运用MEGA 6.06 软件绘制N基因系统进化树,结果表明我国新出现的猪丁型冠状病毒(Ch-A)与国内外报道的猪丁型冠状病毒亲缘关系较远,它单独在一个新的分支上。说明这是在我国新发现的一个新毒株(结果见图6)。
 

  讨论
 

  自2013年至今,新出现的PEDV 和PDCoV 已遍布美国,造成大量猪死亡。目前国际上正在形成该病毒相关研究热点,也发表了少量的报告。但国内至今未见该病毒为主因在猪场暴发和流行的报道。
 

  我们首次报道了国内集约化猪场暴发猪丁型冠状病毒病。通过设计4对冠状病毒引物,在检测PEDV、TGEV 和RTV为阴性后,进一步设计引物扩增PDCoV,显示为强阳性。对PDCoV HN 株的N 基因进行测序,并与国内外已公布的序列进行系统进化树分析。

       结果显示:该PDCoV 毒株(Ch-A)与GenBank 上公布的美国株及中国株不在一个分支上,是新发现的一株新型冠状病毒病。该分支的毒株是否与本次发病的高致病力有关值得深入研究。仍然未知该病毒是怎么传入我国及其在我国各地的感染情况。

 

  老病未消除、新病涌现,需高度重视和立即加强研究对猪丁型冠状病毒的监测和系统性研究,降低给养猪业带来的损失和威胁。

 

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