关键词：猪链球菌 液体 通气培养 灭活疫苗
 

　　一、材料和方法
 

　　1、材料
 

　　牛肉购于回民食品批发市场 ;猪胃购于万吨冷库生鲜批发市场
 

　　各种化学试剂、器械等均由湖北省精牧兽医技术开发有限公司质量监察室提供
 

　　猪链球菌株由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所提供
 

　　2、方法:
 

　　制备马丁肉汤培养基
 

　　⑴猪胃消化液
 

　　猪胃300克 盐酸10毫升 蒸馏水1000毫升 步骤分为消化、煮沸、调PH值、过滤分装、灭菌备用
 

　　⑵牛肉汤
 

　　牛肉500克 水1000毫升 步骤分为加热保温、煮沸、过滤分装、灭菌备用
 

　　制备马丁肉汤时，只需取⑴、⑵的相同数量混合，另按每1000毫升加入氯化钠2.5克，加热至70℃左右调PH7.8-8.0，煮沸10分钟，过滤分装，116℃30-40分钟。
 

　　马丁琼脂培养基
 

　　取马丁肉汤培养基加入一定比例的琼脂，调PH值，121℃30分钟，稍冷却后就可于无菌环境倾倒平皿，也可在倾倒之前按一定的的比例加入血清和裂解血
 

　　二、制备过程
 

　　一级种子的制备：在无菌条件下，开启冻干菌种13株，分别接种到含5-10%无菌血清马丁肉汤培养基试管中，至37℃温箱培养，作为一级种子，与此同时，对冻干菌种进行纯粹检验，将开启的菌种分别涂片，革兰氏染色镜检;然后，分别接种马丁血琼脂平板。37℃需氧培养24h后，分别挑取典型菌落涂片染色镜检，可见革兰氏阳性(紫色)短链球形或卵圆形细菌，也有单个散开或成双排列，无芽孢，有的可见到荚膜。
 

　　二级种子的制备：取经纯粹检验后的一级种子，在无菌条件下分别接种到含5-10%无菌血清马丁肉汤培养基三角烧瓶中，培养基的用量是一级种子的10倍，同时接种一定数量马丁琼脂血清平皿，一起放37℃需氧培养24h作为二级种子， 再次进行纯粹检验，结果与一级种子一致，即可作为二级种子(生产用)
 

　　三、通气培养
 

　　根据发酵罐的构造原理，我们用血清瓶做为罐内层，加热水箱当作罐体夹套的构思，设计了试验的路线，具体方法是：将血清瓶橡胶盖上打孔二个，插入不锈钢管，两头均露出一段，一根不锈钢管的瓶外端接通纯净的压缩空气;瓶的内端连接白乳胶管直至瓶底部，胶管的远端部分钻有一定数量小孔，顶端的圆形开口封闭;另一根不锈钢管的瓶外端连接一个排气球。
 

　　事先要将血清瓶和盖子等附属物件分开包好，121℃30分钟备用，配制马丁肉汤培养基装入其中，121℃30分钟，备用，将血清瓶等用品放车间物流入口，无菌处理， 人员严格按照下列程序进入：
 

　　进入门厅，将携带物品(雨具等)存放于指定位置。
 

　　在更鞋区脱下自己的鞋，换上工作鞋，进入一更衣室，脱外衣裤，放好，摘掉各种饰物用流动纯化水对手部进行清洁，进入二更室更换二更洁净拖鞋，更换洁净服，戴洁净帽、口罩，将衣袖口扎紧，扣好领口，头发全部包在帽子里边不得外露。
 

　　从二更室进入缓冲间，将手伸至感应灭菌器处75%乙醇溶液喷洒消毒;(在手消毒后经洁净走道，到物流入口处，拿取物品放在操作间的物流缓冲间)，通过洁净走道进入三更室，脱掉洁净工作服及内衣裤，进入盥洗室，淋浴，换上无菌内衣裤，穿上万级洁净区连体无菌工作服及洁净拖鞋，戴口罩。手部再次消毒，进入操作间。
 

　　在无菌操作间，加入5-10血清于血清瓶中，加入纯粹检验合格的二级种子，扎好瓶口，拿出在发酵间运用无菌的方法，将血清瓶放置到加温水箱里，水箱的工作控制温度设定在37.5℃，无菌连接纯净压缩空气接口，微调压缩空气调节阀，看到血清瓶内有少量的小气泡产生即可， 每1小时观察记录水箱的温度，进气和产生气泡的情况
 

　　18-24小时，无菌取样，涂片镜检，计数、小白鼠毒性试验、 涂片镜检：与一级种子纯粹检查结果一致，合格;
 

　　细菌计数：采用10倍稀释的方法，9㎝的马丁肉汤琼脂培养基接种稀释好的菌液0.1毫升放置于37℃培养箱培养24小时，计数平皿上的菌落，达到制苗的要求;
 

　　小白鼠毒性试验：腹腔内注射18-24小时的培养物0.2毫升数日内死亡，小白鼠尾巴发绀，剖检肝、脾、肺、心出血，呈败血症。
 

　　灭活：用分析纯甲醛试剂，按1%的用量加入到培养的菌液中，摇动，继续放在水箱中，每隔2小时摇动一次，24小时后用平皿法和动物实验检查灭活效果，无菌生长、动物正常即可进入下一道程序。
 

　　配苗：用生理盐水稀释商品氢氧化铝胶，消毒灭菌后按菌液5、铝胶1的比例混匀，分装、贴签，配好的成品，安检合格、甲醛含量合格。
 

　　四、结论：运用液体通气培养的方法制备猪链球菌疫苗，设计思路、操作程序、制备工艺是成功的，车间生产可借鉴其过程，对指导生产有一定的实用价值。