N-乙基-N-亚硝基脲(N-Ethyl-N-nitrosourea, ENU)是一种较强的基因诱变剂,能在相对较短的时间内诱导产生大量随机突变表型,进一步通过表型筛选及遗传试验可能获得具有特殊表型的突变系动物,可用于建立人类遗传性疾病研究的新模型,在一定程度上还可以作为验证基因功能的一种参考方法。ENU具有较大的细胞毒性,给药后往往会导致雄性实验动物生殖能力的下降甚至不育,目前ENU诱变的实验动物一般为小鼠,而小鼠的解剖与生理功能与人相差较大,并且小鼠的精液不易采集,很难对其生殖功能进行长期监控。猪的解剖与生理功能与人较为相似,特别是小型猪已成为医学实验上重要的实验材料。利用小型猪巴马香猪做为实验动物,通过ENU诱导建立大型哺乳动物基因突变模型和人类疾病动物模型,在理论和医学实践上均具有重要价值。
 

      小鼠诱变实验的结果表明,ENU剂量的选择十分重要,一个适宜的剂量不仅能诱导DNA突变,而且还要保障实验动物的生殖功能在停药后可以逐渐恢复,从而使获得的突变能够遗传下去。本研究针对ENU诱变过程适宜剂量筛选这一关键问题,在研究巴马香猪精液品质特征的基础上,长期监控ENU处理对公猪生殖功能的影响,筛选到了既能诱导可疑表型,又能保证在ENU停药后,公猪生殖功能能基本恢复正常的适宜剂量。试验首先检测了90头健康成年巴马香猪新鲜精液质量,并探索液冷冻保存的方法。

    成年巴马香猪射精量、精液活力、密度、畸形率、抗力指数分别为95.31m1,75.33%,0.78x108,5.13%及581,其中,巴马香猪的射精量、精子活力和密度均低于杜洛克和约克夏等商品猪。在巴马香猪精液冷冻研究中,采用正交实验设计,在探讨低密度脂蛋白(LDL)浓度、甘油浓度、海藻糖浓度作用的基础上,进一步结合15℃平衡时间和解冻方法对冷冻解冻后精子活率的影响,进行巴马香猪精液最佳冻存方案的优化。结果表明方案1(A3B4C2D3E1)为最佳方案,其解冻后精子活率为52.26%。

      为分析稀释液与冷冻液中LDL、甘油和海藻糖不同联用组合的保护效果,在方案1的基础上,共设计了4种组合,以精子运动能力、顶体完整性、质膜完整性以及DNA损伤率等为判定指标,结果表明,9%的LDL、200mM海藻糖与2%的甘油联用时(即组合4)显著优于其他组合的保护效果(P<0.05),并进一步证明方案1是巴马香猪精液冷冻保存的最佳方案。巴马香猪ENU给药当天各剂量组猪只采食量与对照组相比极显著地降低(P<0.01),然后逐渐(给药后第5-6天)恢复直至正常(与对照组无显著差异,P>0.05);待第2周(次)、第3周(次)重复给药时,会出现同样的变化趋势。ENU给药期间巴马香猪采食量会受到较大影响,采食量的减少具有浓度依赖性,采食量恢复时间随剂量的增加而延长。给药后各剂量组公猪的生长速度都有一定程度降低。随ENU给药剂量的增加,巴马香猪的死亡率逐渐升高,可育率逐渐降低。

       结果表明,巴马香猪对85mg/kg及以下剂量可耐受。巴马香猪ENU给药后12月内射精量呈现先下降后上升的趋势,给药后第12月,65mg/kg及以下剂量组巴马香猪射精量基本恢复正常;75-105mg/kg剂量组射精量均不能恢复到给药前水平,但75mg/kg剂量组公猪射精量恢复情况好于85-105mg/kg剂量组公猪(P<0.05),85-105mg/kg剂量组公猪之间射精量无显著性差异(P<0.05)。巴马香猪精子活力先下降后上升,给药后第12月,45mg/kg和65mg/kg剂量组公猪精子活力能够恢复到给药前水平,75-105mg/kg剂量组公猪均不能恢复到给药前水平,75mg/kg和85mg/kg剂量组公猪精子活力恢复情况好于90-105mg/kg剂量组公猪(P<0.05),90-105mg/kg剂量组公猪之间精子活力无显著性差异(P<0.05)。巴马香猪精液密度也表现为先下降后上升,45mg/kg和65mg/kg剂量组公猪精液密度能够恢复到给药前水平,75-105mg/kg剂量组公猪均不能恢复到给药前水平,其中75mg/kg剂量组公猪精液密度恢复情况好于85mg/kg剂量组(P<0.05),后者精液密度恢复好于90-105mg/kg剂量组公猪(P<0.05)。

       巴马香猪精子畸形率先上升后下降,45mg/kg和65mg/kg剂量组公猪精子畸形率能够恢复到给药前水平,75-105mg/kg剂量组公猪均不能恢复到给药前水平,其中75mg/kg和85mg/kg剂量组精子畸形率恢复好于90-105mg/kg剂量组公猪(P<0.05)。给药后18月公猪射精量显著高于给药后12月(P<0.05),表明公猪副性腺的精浆分泌功能有所恢复,其他精液指标无显著差异,表明ENU给药后12月公猪精液生成和精子发生的能力恢复情况已经基本稳定。ENU给药后公猪配种记录表明,45mg/kg和65mg/kg剂量组公猪的与配母猪妊娠率与对照组无显著差异(P>0.05),其他各剂量组均与对照组均有显著差异(P<0.05),并且有随着剂量增大与配母猪妊娠率降低趋势更为明显的现象;断奶仔猪成活率的差异未表现出与给药剂量之间的相关性：各剂量组公猪(F0代)所生产的F1代仔猪可疑表型发生率均与对照组有显著差异(P<0.05),其中45mg/kg和65mg/kg剂量组仔猪可疑表型发生率显著低于105mg/kg剂量组(P<0.05),75-95mg/kg剂量组与105mg/kg剂量组仔猪可疑表型发生率无显著差异(p>0.05)。

      结合公猪对ENU的耐受性与仔猪可疑异常表型发生率考虑,75-85mg/kg属于巴马香猪ENU诱变的合适剂量。ENU给药后18个月对巴马香猪生殖器官和副性腺进行组织学检测,结果表明,巴马香猪的睾丸系数、附睾系数和精囊腺系数与对照组相比,除了45mg/kg和65mg/kg剂量组外,85-105mg/kg剂量组巴马香猪附睾系数和精囊腺系数均显著低于对照组,表明生殖器官和副性腺已受到了损伤;随着ENU给药剂量的增加,公猪睾丸内正常曲细精管减少,部分变性萎缩和完全变性萎缩的曲细精管比例上升;曲细精管内各级生精细胞与支持细胞的比例也随着ENU剂量的增加而降低。ENU给药对巴马香猪前列腺无明显影响。透射电镜下给药组可见部分精原细胞核出现空泡、精子核解聚,严重者可见部分精原细胞核解聚,部分精子细胞核膜消失。免疫组化实验结果表明,曲细精管中GDNF蛋白的表达量随着ENU剂量的增大而降低,表明ENU剂量越大,曲细精管损伤程度越大,公猪支持细胞分泌GDNF蛋白的能力越低,精原干细胞自我更新的能力也因此而下降,随之各级生精细胞数量减少,公猪表现为生精障碍和精液品质的降低。随着ENU给药剂量的增加,曲细精管内生精细胞凋亡数量逐渐升高,也是公猪生精能力降低的主要原因之一。激素水平跟踪检测结果表明,ENU注射前各剂量组公猪血清T和E2的水平无显著差异(P>0.05);给药后4月,除45mg/kg剂量组公猪血清T和E2水平与对照组无显著差异(P>0.05)外,其他剂量组与对照组均有显著差异(P<0.05),T水平显著低于对照组(P<0.05),而E2水平显著高于于对照组(P<0.05)。表明ENU给药后,随着巴马香猪睾丸细胞的变性,T和E2的分泌均受到了较大影响,而这2种生殖内分泌激素水平的异常既是公猪精液品质变化的标志,也是引起精液品质变化的原因之一。

       试验最后对ENU影响巴马香猪精子发生的分子机制进行了研究。睾丸分泌雄性激素和产生精子这两种功能的实现需要在相关基因的调控下完成,其中,StAR基因和P450scc基因主要与睾酮合成相关;GDNF基因、SCF基因和CREM基因主要与精子发生相关;在精子发生过程中,同时也伴随着生精细胞的凋亡,在外源性因素作用下,细胞凋亡的速度会有所变化,在细胞凋亡的线粒体介导途径中,Bcl-2家族中抑制细胞凋亡的Bcl-2基因和促进细胞凋亡的Bax基因的表达水平对细胞的生存与死亡起到决定性的作用。实验结果表明,除105mg/kg剂量组公猪睾丸组织中StAR基因表达量显著低于对照组(P<0.05)外,其他剂量组所受影响不大;45mg/kg和65mg/kg剂量组P450scc基因的表达量与与对照组均无显著差异(P>0.05),75和85mg/kg剂量组的表达量显著低于对照组(P<0.05),90-105mg/kg剂量组公猪睾丸内P450scc基因的表达量显著低于其他各剂量组(P<0.05),提示ENU给药后公猪睾酮水平的下降可能主要与P450scc基因表达的降低有关。

       GDNF基因和CREM基因的表达情况大致相同,即45mg/kg和65mg/kg剂量组公猪睾丸内GDNF基因的表达量基本未受影响(P>0.05),75-105mg/kg剂量组公猪睾丸内GDNF基因的表达量均显著降低(P<0.05),而且随剂量的增加其表达量降低的幅度越大,表明随着ENU给药剂量的增加,公猪睾丸曲细精管内精原干细胞的自我更新能力逐渐减弱,成熟的精子细胞变少,剂量达到90mg/kg以上时,公猪精原干细胞自我更新及精子成熟会严重受阻。45mg/kg和65mg/kg剂量组公猪睾丸内BAX基因的表达量与对照组无显著差异(P>0.05),75-105mg/kg剂量组BAX基因的表达量显著高于对照组(P<0.05),并且差异随ENU剂量的加大而升高(P<0.05),而各剂量组Bcl-2基因的表达量与对照组均无显著差异(P>0.05),提示除45和65mg/kg剂量组外,公猪睾丸内生精细胞的凋亡程度随剂量的增加而加大,并且当ENU给药剂量增加至90mg/kg以上时,生精细胞凋亡水平较高,生精细胞数量减少,其精液质量有较大水平的降低。

       综上所述,本研究可以得到如下结论：(1)成年巴马香猪正常的射精量、精液活力、密度、畸形率、抗力指数分别为95.31ml,75.33%,0.78x108,5.13%及581;(2)巴马香猪最佳精液冷冻-解冻方法是精液稀释液中添加9%的LDL和200mM海藻糖,冷冻液中添加2%的甘油,降温过程中于15℃平衡3小时,并于37℃下解冻45s;(3)ENU给药后巴马香猪的采食量下降,生长速度变慢,死亡率和不育率随给药剂量的增加而升高,对90mg/kg及以上剂量不耐受;(4)随着ENU给药剂量的增加,公猪血清T水平下降,E2水平上升,公猪睾丸、附睾和精囊腺受损程度加重,巴马香猪的精液质量降低;(5)ENU给药后,公猪睾丸组织P450scc基因、GDNF基因和CREM基因表达下降,BAX基因表达水平上升,公猪睾丸生精能力受损;(6)根据巴马香猪对ENU可耐受性和生精功能变化的综合分析,最佳ENU诱变剂量可初步确定为75-85mg/kg。