将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。可以实时定量检测目标的基因拷贝数。
 

　　优势
 

　　方便，快捷，灵敏，非常微量的样品，在几个小时内就可以出结果。
 

　　劣势
 

　　1、无法区别活的病毒和死亡的病毒，检测的结果只是病毒的基因拷贝数，跟活病毒数量无关。
 

　　针对这个问题，可以进行一个小实验。疫苗企业、猪场、检测单位如果有兴趣均可以试试。方法很简单，选择同一批次的三瓶疫苗，选择其中一瓶疫苗，加入适量甲醛灭活，然后与不灭活的剩余两瓶疫苗同时使用荧光定量PCR方法检测，看其检测结果。
 

　　2、无法鉴别出BVDV和猪瘟病毒的基因容易出现假阳性。
 

　　3、受操作影响较大，定量数据有一定偏差。
 

　　4、检测出的基因拷贝数跟在猪体上的免疫效果没有直接相关性。
 

　　5、没有标准可以参考，各自为战。
 

　　用处
 

　　使用实时荧光定量PCR方法只能大致定量疫苗中的病毒基因数量，无法确定猪瘟疫苗中的活病毒的抗原含量，只可以在同等条件下大致评估疫苗中的基因含量高低，检测出的基因拷贝数量跟疫苗中的活病毒数量和免疫效果完全没有相关性。
 

　　目前，实时荧光定量PCR均是各个检测机构的自建方法，检测流程、引物与耗材等均按照自己的标准进行，没有国家标准可以参考，而且进行操作的实验室环境控制参差不齐。因此，同一个样品，可能各个试验室检测的结果会有明显偏差。
 

　　二、兔体感染量(RID)检测
 

　　按照疫苗瓶签注明的头份，使用生理盐水按照内控标准进行稀释，然后接种家兔，上下午各测体温一次，48小时后每隔6小时测定体温一次，当兔子出现典型的定型热反应时，疫苗判断合格。按照能够引起兔子出现定型热的最大稀释倍数，确定为疫苗的效价。比如，ST猪瘟活疫苗，每头份稀释20000倍时，免疫兔子后兔子仍然能够出现定型热反应，则效价为20000RID。
 

　　使用兔体感染量检测猪瘟抗原含量是目前猪瘟疫苗效力检测的国家标准，所有的猪瘟疫苗生产企业均使用该方法来判定猪瘟疫苗效力质量。这一点，可以从企业猪瘟疫苗产品的批签发文件上显示出来。
 

　　优势
 

　　1、可以检测出疫苗中的有效活病毒的数量，以兔体感染量来衡量，避免死亡病毒干扰。
 

　　2、可以避免BVDV病毒的干扰。
 

　　3、与猪体的免疫效果直接相关。
 

　　存在不足之处
 

　　1、使用活体兔子检测，对于试验动物要求较高，受试验动物的质量影响较大， 因此一般的检测机构难以操作。
 

　　2、程序繁琐，工作量大。
 

　　3、检测成本高。
 

　　目前，按照国家标准，猪瘟疫苗效力是使用兔体反应量来进行检测的，其中，猪瘟活疫苗(兔源)国家标准是150RID，猪瘟活疫苗(细胞源)的国家标准是750RID，猪瘟活疫苗(传代细胞源)的国家标准是7500RID。按照规定，企业的内控标准均要高于国家标准。比如目前永顺生物的ST猪瘟活疫苗(传代细胞源)的企业内控标准是20000RID，猪瘟活疫苗(细胞源)的企业内控标准是7500RID。如果企业生产的产品质量低于国家标准则为不合格产品，如果不合格产品上市，造成经济损失可以通过法律索赔。
 

　　总结
 

　　由于猪瘟病毒在细胞上不会出现细胞病变，因此难以准确定量。
 

　　实时荧光定量PCR在技术上是相对先进的，具有方便、快捷与灵敏的特点，但是却有严重缺陷，即无法鉴别出活病毒基因和死病毒基因，以及很难鉴别出猪瘟病毒基因和BVDV病毒基因，并且检测出的拷贝数跟疫苗免疫后的抗体水平没有直接相关性，因此只能作为一种辅助参考指标。
 

　　而国外的猪瘟疫苗病毒定量使用猪体半数感染量(PD50)来判断，但是在中国很难买到合格的试验猪，开展起来比较困难。因此，目前国内检测猪瘟疫苗效价的国家标准是使用兔子测定猪瘟疫苗的兔体感染量，该检测方法虽然较为繁琐，但经过大量的生产数据验证，与免疫猪后抗体水平是直接相关的，是检测猪瘟疫苗最切实可靠的方法。