检测秘鲁PEDV新毒株的分子检测法

来源：湖南新南方养殖服务公司 2015-06-09 16:52:01| 查看：次

中国养猪网讯:

　　前言

　　猪流行性腹泻（PED）是一种由冠状病毒科的猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的一种肠道疾病。PED是一种急性、高度传染性的肠道疾病，临床特征为水样腹泻、呕吐和严重脱水，7日龄仔猪的死亡率可达到100%（1、2、3）。在秘鲁，PEDV被认为是一种外来的疾病，因为没有证据表明PEDV的存在。然而，利马的五个猪场21日龄以内的仔猪出现水样腹泻、呕吐和严重脱水，，造成了近100%的发病率和死亡率，它被怀疑是PEDV所致。因此，本研究的目的是报告秘鲁养猪场存在猪流行性腹泻病毒（PEDV）的感染情况。

　　材料和方法

　　从秘鲁北部利马5个猪场采集5–21日龄仔猪临床疑似PEDV感染的样品，共有25份水样粪便和/或肠道。我们使用快速检测试纸（Bionote、韩国）建立一个快速诊断PEDV的方法。阳性样品通过特异的实时
RT-PCR检测PEDV的S基因获得，实验按协议在圣马科斯国立大学的兽医系微生物和寄生虫学实验室进行。阳性对照由米格尔博士（SENASA-秘鲁）提供。猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）荷兰毒株的RNA由瑞
典国家兽医研究所（SVA）提供，古典猪瘟病毒Alfort-187株（CSFV）由j.Pasick博士（加拿大食品检验署）提供并将这两种病毒作为阴性对照。

　　简单的说：根据制造商的操作手册用色谱测试（Bionote、韩国）粪便和肠道样品。RNA提取，样品用水稀释5倍，用商品化的二氧化硅透析膜提取病毒RNA（Qiamp病毒RNA，美国）。提取出来RNA后，
我们使用Superscript™III第一链试剂盒（Invitrogen，USA）进行逆转录反应。用2μlcDNA来进行S基因的实时PCR扩增，片段长101bp。使用的引物分别是PEDVFW:5'gcacttattggcaggctttgt3'和
PEDVRW:5'ccattgagaaaagaaagtgtcgtag3'。

　　结果

　　使用快速检测试纸检测样品的PEDV阳性率为23/25（92%）并且该结果经实时RT-PCR证实。阳性样品的扩增阈值在13和21个循环之间。阳性样品和阳性对照只有一个特异的融解曲线（Tm，77.7°C）。
阴性对照TGEV和CSFV没有明显的扩增曲线和融解曲线。

　　结论和讨论

　　在秘鲁，PEDV被认为是一种外来的疾病，因为没有证据表明PEDV的存在。这个摘要第一次报告了使用快速检测试纸和实时RT-PCR证实在秘鲁存在PEDV的感染。2013年5月初，美国爆发PEDV，导致仔
猪的高发病率和死亡率。目前，我们通过测定这些样品的序列以便确定病毒的起源及其遗传特性。初期的研究显示，秘鲁和北美的毒株有较强的遗传联系。

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